Pureté HPLC et identité par spectrométrie de masse : ce que chacune prouve
Deux chiffres analytiques apparaissent sur presque tous les certificats d'analyse de peptides, et ils sont régulièrement confondus. Ils répondent à des questions différentes, et aucun des deux ne suffit à lui seul.
La spectrométrie de masse répond à : est-ce la bonne molécule ?
La spectrométrie de masse mesure un rapport masse/charge, que l'instrument convertit en poids moléculaire. Ce poids observé est comparé au poids théorique calculé à partir de la séquence.
S'ils correspondent dans la tolérance, le matériel du flacon est bien la molécule que l'étiquette revendique. C'est la confirmation d'identité, et elle est de nature binaire — elle correspond ou ne correspond pas.
Ce que la spectrométrie de masse ne vous dit pas, c'est la proportion du flacon occupée par cette molécule. Un échantillon composé à 60 % du peptide cible et à 40 % de fragments tronqués peut tout de même produire une confirmation d'identité nette pour la cible.
La HPLC répond à : quelle proportion est la bonne molécule ?
La HPLC en phase inverse sépare les composants par hydrophobicité. Le détecteur rapporte l'absorbance au fil du temps, produisant des pics. La pureté est exprimée comme la surface du pic principal en pourcentage de la surface totale des pics, à une longueur d'onde donnée.
Trois nuances à retenir :
- C'est un pourcentage de surface, pas un pourcentage massique. Des molécules différentes absorbent différemment à une longueur d'onde donnée, si bien que la surface d'un pic est un indicateur indirect de la quantité, pas une mesure directe.
- Elle ne compte que ce qui élue et absorbe. Les sels, les contre-ions et l'eau résiduelle ne contribuent en rien au chromatogramme — c'est pourquoi un peptide pur à 99 % peut malgré tout représenter une minorité de la poudre en masse. C'est justement le rôle du chiffre de teneur en peptide.
- La longueur d'onde compte. 214 nm détecte la liaison peptidique et voit pratiquement tout ce qui est peptidique. 280 nm détecte les résidus aromatiques et manquera les séquences qui en sont dépourvues.
Pourquoi il faut les deux
| Question | Réponse apportée par |
|---|---|
| Est-ce la molécule indiquée sur l'étiquette ? | Spectrométrie de masse |
| Quelle proportion de l'échantillon est cette molécule ? | Pureté HPLC |
| Quelle quantité de peptide se trouve réellement dans le flacon ? | Teneur en peptide / masse nette de peptide |
Un certificat d'analyse ne comportant qu'un seul de ces trois éléments laisse une véritable lacune. Un certificat comportant les trois vous permet de calculer ce que vous possédez réellement.
Comparer entre fournisseurs
Les chiffres de pureté ne sont comparables que si la méthode l'est aussi. Avant de considérer « 99 % » d'une source comme meilleur que « 98 % » d'une autre, vérifiez que les deux correspondent à une HPLC en phase inverse à la même longueur d'onde de détection, et que les deux montrent le chromatogramme. Une revendication de pureté sans indication de méthode ni tracé n'est pas une mesure que vous pouvez comparer à quoi que ce soit.
Aegis Bio fournit un certificat d'analyse sur demande pour le lot fourni, couvrant la pureté HPLC et la confirmation d'identité par spectrométrie de masse. Voir la section qualité et documentation pour ce qui est conservé au dossier.
Tous les matériels sont fournis exclusivement pour la recherche en laboratoire in vitro et ne sont pas destinés à un usage humain ou vétérinaire.