Cómo leer un cromatograma de HPLC
La cifra de pureza de un certificado es un resumen del cromatograma. El trazado en sí lleva información que el resumen descarta, y toma unos treinta segundos leerlo una vez que se sabe qué buscar.
Los ejes
El tiempo corre a lo largo de la parte inferior — cuánto tardó cada componente en atravesar la columna y llegar al detector. La absorbancia corre hacia arriba en el lateral. Un componente que interactúa más fuertemente con la columna permanece más tiempo y aparece más a la derecha.
El pico principal
Alto, aproximadamente simétrico, y responsable de la mayor parte del área total. Dos características merecen atención.
Simetría. Un pico que sube abruptamente y desciende lentamente — colas o "tailing" — puede indicar interacciones secundarias con la columna, sobrecarga, o una muestra que no está completamente disuelta. Un ligero efecto de cola es habitual; un efecto de cola pronunciado amerita una consulta.
Hombros. Un abultamiento en el flanco del pico principal es una impureza estrechamente relacionada que el gradiente no resolvió del todo. Este es el hallazgo más común que vale la pena investigar, porque un hombro suele ser una secuencia con un residuo faltante o una forma oxidada — lo bastante similar estructuralmente como para coeluir, y por lo tanto a veces se integra dentro del pico principal, inflando la cifra de pureza.
El resto del trazado
Los picos pequeños en otras zonas son sustancias relacionadas, residuos de reactivos o productos de degradación. Lo que importa es su distribución. Un único pico de 1.5% y una decena de picos de 0.15% dejan a ambos en 98.5% de pureza, pero describen materiales distintos — el primero es una impureza identificable, el segundo es degradación general.
Los picos muy al inicio de la corrida, cerca del frente del solvente, suelen ser sales y moléculas pequeñas que no interactúan con la columna. A menudo se excluyen de la integración.
La línea base
Debe ser plana y estable. Una deriva en la línea base es normal en corridas con gradiente a medida que cambia la composición de la fase móvil. Una línea base ruidosa o errática hace que la integración no sea confiable, lo que a su vez hace que la cifra de pureza no lo sea.
Tiempo de retención
La consistencia entre lotes es una señal de identidad útil. La misma secuencia con el mismo método debería eluir en un tiempo muy similar. Un material que de pronto eluye notablemente antes o después amerita una consulta, incluso si la cifra de pureza no cambia.
Lo que el trazado no le dice
No identifica nada. Un único pico limpio confirma que una cosa está presente en alta proporción, no que sea la molécula de la etiqueta — eso es lo que establece la espectrometría de masas. Y no dice nada sobre qué proporción del polvo es péptido, que es la cifra de contenido peptídico.
Pureza, identidad y contenido son tres preguntas distintas. Un certificado completo responde las tres.
Todos los materiales se suministran exclusivamente para uso en investigación de laboratorio in vitro y no son para uso humano ni veterinario.